無菌檢查法

無菌檢查法
附錄Ⅺ H 無菌檢查法
無菌檢查法系指檢查藥品、敷料、縫合線、無菌器具及適用于藥典要求無菌檢查的
其他品種是否無菌的一種方法。 
無菌檢查在潔凈度100級單向流空氣區域內進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作,防
止微生物污染。單向流空氣區與工作臺面，必須進行潔凈度驗證。 
生物制品的無菌檢查，應按《中國生物制品規程》中有關無菌檢查的規定辦理。 
培養基及其制備方法 
培養基應適合需氣菌、厭氣菌或真菌的生長，可按以下處方制備，亦可使用按該處
方生產的符合規定的脫水培養基。以下培養基制備時，均以115℃滅菌30分鐘。
1.需氣菌、厭氣菌培養基(硫乙醇酸鹽流體培養基) 
酪胨（胰酶水解） 15g 氯化鈉 2.5g 
葡萄糖 5g 新配制的0.1％刃天青溶液 1.0ml 
L－胱氨酸 0.5g (或新配制的0.2％亞甲藍溶液0.5ml) 
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.5～0.7g 
(或硫乙醇酸0.3ml) 水 1000ml
酵母浸出粉 5g 
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內，微溫溶解后，調節pH為弱堿性，
煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌后為7.1±0.2，分裝，
滅菌。 
在供試品接種前, 培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5，否則,須
經水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。 
2.真菌培養基 
胨 5g 　　　　　磷酸氫二鉀 1g 
酵母浸出粉 2g 硫酸鎂 0.5g 
葡萄糖 20g

水 1000ml 
除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解后，調節pH值約為6.8，煮沸,加葡萄
糖溶解后，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。 
3.選擇性培養基 
(1) 對氨基苯甲酸培養基（用于磺胺類藥物的無菌檢查） 照上述需氣菌、厭氣菌
培養基及真菌培養基的處方及制法，各加對氨基苯甲酸0.125g，溶解后，搖勻,分裝,滅
菌。 
(2) 聚山梨酯80培養基（用于油劑藥品的無菌檢查） 照上述需氣菌、厭氣菌培養基
及真菌培養基的處方及制法，各加10ml聚山梨酯80，搖勻，分裝，滅菌。 
4.營養肉湯培養基 
胨 10g 肉浸液 1000ml 
氯化鈉 5g 
取胨和氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解后，調節pH為弱堿性，煮沸，濾清，調節pH
值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。 
5.營養瓊脂培養基 
照上述營養肉湯培養基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌后為7.2
±0.2，分裝，滅菌。 
6.0.5％葡萄糖肉湯培養基 
胨 10g 葡萄糖 5g 
氯化鈉 5g 肉浸液 1000ml 
取胨和氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解后，調節pH為弱堿性，煮沸，加葡萄糖溶解
后，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌后為7.2±0.2，分裝，滅菌。 
　　7.真菌瓊脂培養基 
照真菌培養基的處方及制法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌后為6.4±0.2,分
裝，滅菌，趁熱斜放使凝固成斜面。 
上述培養基分別按15ml與40ml或需要量分裝于試管功其他容器中，裝量約為試管或
容器高度的2/5，按規定的溫度和時間滅菌。細菌培養基經30～35℃培養48小時,真菌培
養基經20～25℃培養72小時后，應無菌生長。 【附注】 肉浸液制備法 取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎后，每1000
g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時，煮沸1小時，濾過，壓干肉渣,補
足液量，分裝，滅菌，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代
替。 
培養基質量應通過靈敏度檢查。 
培養基靈敏度檢查法 
1.菌種 (1)藤黃微球菌(Micrococcus Luteus)[CMCC(B)28001] 
(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941] 
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]　　　　　　　　　　　　 
2.操作 (1)取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面和白色念珠菌的真菌培養基瓊脂斜面的新
鮮培養物,分別用0.9％無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；將生孢梭菌不含瓊脂的需氣
菌、厭氣菌培養基新鮮培養物，吸入無菌離心管，離心，棄去上清液,菌體用0.9％無菌
氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液。分別取上述菌懸液,用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至與細
菌濁度標準管相同的濃度, 然后作10倍系列稀釋，制成1ml中含10～100個菌并計數?！　　　　　　　　　　　　?2)將藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物,白色念珠菌的真
菌培養基的新鮮培養物1ml，用0.9％無菌氯化鈉溶液作10倍系列稀釋,制成1ml中含10～
100個菌并計數。
將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣
菌、厭氣菌培養基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml，分別接種至每管裝
量為12ml的需氣菌、厭氣菌培養基3管,白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋菌液各1ml,接
種至每管裝量為9ml的真菌培養基3管,以未接種的培養基作對照，按規定的溫度培養5天
并逐日記錄結果。
3.結果判定 以每株菌接種后的培養基不得少于2管呈現生長，即該培養基的靈敏
度檢查符合要求。
對照用菌液 
1.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌液 取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)
26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物1白金耳，接種至營養肉湯培養基內,在30～35℃培養
16～18小時后，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個菌。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液 取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣
菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳,接種至相同培養基內，在30～35℃培養18～24小
時，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個菌。
　　3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液 取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的真菌瓊
脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳,接種至真菌培養基內，在20～25℃培養24小時后，用
0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋至每1ml中含10～100個菌。
抑細菌和抑真菌試驗
在用直接接種法無菌檢查前，可用如下方法測定供試品是否具有抑細菌和抑真菌作
用。用需氣菌、厭氣菌培養基4管及真菌培養基2管，分別接種金黃色葡萄球菌、生孢梭
菌、白色念珠菌均10～100個菌各兩管，其中1管加供試品規定量，所有培養基管置規定
的溫度，培養3～5天。如培養基各管24小時內微生物生長良好，則供試品無抑菌作用。
如加供試品的培養基管與未加供試品的培養基管對照比較，微生物生長微弱、緩慢或不
生長，均判為供試品有抑菌作用。該供試品需用稀釋法（種入較大量培養基中）或中和
法、集菌儀薄膜過濾法處理，消除供試品的抑菌性后，方可接種至培養基。
檢查法
無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法全封閉集菌器。前者適用于非抗菌作用的供試品，后
者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。
操作時，應用適當的消毒液對供試品容器表面或外包裝浸沒或擦拭消毒后，以無菌
的方法取內容物。
凡無菌檢查中，均應取相應溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。
1. 直接接種法 
(1) 供試品準備 供試品如為注射液、供角膜穿通傷及手術用的滴眼劑或滅菌溶
液，按表1或表2規定量取供試品，混合。
供試品如為注射用無菌粉末或無菌凍干品或供直接分裝成注射用的無菌粉末原料，
按表1或表2規定量取供試品，加入無菌水或0.9％無菌氯化鈉溶液,或該藥品項下規定的
溶劑用量制成一定濃度的供試品溶液。 
供試品如為外科敷料，取供試品4個包裝,以無菌操作拆開包裝，于不同部位分別剪
取約100mg或1cm×3cm的供試品11份；腸線、縫合線取小包裝5個，拆開包裝，共取11
股，接種于足以浸沒供試品的適量培養基中。 
供試品如為滅菌醫用器具，依樣品大小、形狀的不同，取供試品11個，接種于足以
浸沒供試品的適量培養基中?；蛴?.9％無菌氯化鈉溶液各40ml，分別沖洗內壁（輸血、
輸液袋）收集各沖洗液，混合，按薄膜過濾法檢查。
供試品如為青霉素類藥品，按表1或表3規定量取供試品，分別加入足夠使青霉素滅
活的無菌青霉素酶溶液適量，搖勻，混合。亦可按上海秉越集菌儀薄膜過濾法檢查。
供試品如為放射性藥品，取供試品1瓶（支），接種于裝量為7.5ml的培養基中。每
管接種量為0.2ml。
2.操作 取上述備妥的供試品,以無菌操作將該供試品分別接種于需氣菌、厭氣菌
培養基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌對照用菌液1ml，作陽性對照,另接種于真菌培
養基5管。輕輕搖動,使供試品與培養基混合。需氣菌、厭氣菌培養基管置30～35℃、真
菌培養基管置20～25℃培養7日。在培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照
管在24小時內應有菌生長，如在加入供試品后，培養基出現渾濁，培養7天后,不能從外
觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中或斜面培養基上
繼續培養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再出現渾濁或斜面有無菌生長，或用
接種環取培養液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。 2. 薄膜過濾法 
如供試品有抗菌作用，按表1或表3規定量取供試品，按該藥品項下規定的方法處理
后, 加入0.9％無菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑至少100ml中, 混合后，通過裝有孔徑
不大于0.45μm的薄膜過濾器，然后用0.9％無菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶液沖洗濾膜
至陽性對照菌正常生長。將需氣菌、厭氣菌培養基，真菌培養基用陽性對照管用培養基
分別加至薄膜過濾器內（全封閉式過濾器），或取出濾膜分成3等份,分別加入上述二種培
養基中，按規定溫度和時間培養。陽性對照管應根據供試品特性加入相應對照菌液1ml(
抗細菌藥物，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對照菌；抗真
菌藥物，以白色念珠菌為對照菌)。陽性對照管細菌應在培養24～48小時，真菌應在培養
24～72小時有菌生長。
結果判斷 
當陽性對照管顯渾濁并確有細菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據觀察所得的結
果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管均為澄清或雖顯渾濁但經證明并非有菌生長,
均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管中任何1管顯渾濁并確證為有
菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有
菌生長，否則應判為供試品不合格。